HYPOXIC STRESS, HEPATOCYTES AND CACO-2 VIABILITY AND SUSCEPTIBILITY TO Shigella flexneri INVASION / Stress hipóxico, viabilidade e susceptibilidade de hepatócitos e células Caco-2 à invasão por Shigella flexneri

SUMMARY Inflammation due to Shigella flexneri can cause damage to the colonic mucosa and cell death by necrosis and apoptosis. This bacteria can reach the bloodstream in this way, and the liver through portal veins. Hypoxia is a condition present in many human diseases, and it may induce bacterial translocation from intestinal lumen. We studied the ability of S. flexneri to invade rat hepatocytes and Caco-2 cells both in normoxic and hypoxic microenvironments, as well as morphological and physiological alterations in these cells after infection under hypoxia. We used the primary culture of rat hepatocytes as a model of study. We analyzed the following parameters in normoxic and hypoxic conditions: morphology, cell viability, bacterial recovery and lactate dehydrogenase (LDH) released. The results showed that there were fewer bacteria within the Caco-2 cells than in hepatocytes in normoxic and hypoxic conditions. We observed that the higher the multiplicity of infection (MOI) the greater the bacterial recovery in hepatocytes. The hypoxic condition decreased the bacterial recovery in hepatocytes. The cytotoxicity evaluated by LDH released by cells was significantly higher in cells submitted to hypoxia than normoxia. Caco-2 cells in normoxia released 63% more LDH than hepatocytes. LDH increased 164% when hepatocytes were submitted to hypoxia and just 21% when Caco-2 cells were in the same condition. The apoptosis evaluated by Tunel was significantly higher in cells submitted to hypoxia than normoxia. When comparing hypoxic cells, we obtained more apoptotic hepatocytes than apoptotic Caco-2 cells. Concluding our results contribute to a better knowledge of interactions between studied cells and Shigella flexneri. These data may be useful in the future to define strategies to combat this virulent pathogen. .

RESUMO A inflamação causada por Shigella flexneri pode causar danos à mucosa do cólon e morte celular por necrose e apoptose. Esta bactéria pode atingir a corrente sanguínea por esta via e o fígado através da veia porta. A hipóxia é uma condição presente em muitas doenças humanas, podendo induzir a translocação bacteriana a partir do lúmen intestinal. Nós estudamos a capacidade de S. flexneri invadir hepatócitos de rato e células Caco-2 nos microambientes de normóxia e hipóxia, bem como as alterações morfológicas e fisiológicas dessas células após a infecção sob hipóxia. Utilizamos a cultura primária de hepatócitos de ratos como modelo de estudo. Nós analisamos os seguintes parâmetros em condições de normóxia e hipóxia: morfologia, viabilidade celular, recuperação bacteriana e liberação de lactato desidrogenase (LDH). Os resultados mostraram menor quantidade de bactérias dentro das células Caco-2 do que em hepatócitos em condições de normóxia e hipóxia. Nós observamos que quanto maior foi a multiplicidade de infecção (MOI), maior também foi a recuperação bacteriana em hepatócitos. A condição hipóxica foi capaz de diminuir a recuperação de bactérias dos hepatócitos. A citotoxicidade avaliada pela liberação de LDH foi significativamente maior em células submetidas à hipóxia do que normóxia. As células Caco-2 em normóxia produziram 63% mais LDH do que os hepatócitos. O LDH aumentou 164% quando os hepatócitos foram submetidos à hipoxia e apenas 21% quando as células Caco-2 estavam na mesma condição. A apoptose avaliada por TUNEL foi significativamente ...

Tnf-a production and apoptosis in hepatocytes after listeria monocytogenes and salmonella typhimurium invasion / Produção de tnf-a e apoptose em hepatócitos após invasão por listeria monocytogenes e salmonella typhimurium

Invasion of hepatocytes by Listeria monocytogenes (LM) and Salmonella Typhimurium (ST) can stimulate tumor necrosis factor alpha (TNF-α) release and induce apoptosis. In this study, we compared the behavior of hepatocytes invaded by three L. monocytogenes serotypes (LM-4a, LM-4b and LM-1/2a) and by ST to understand which bacterium is more effective in the infectious process. We quantified TNF-α release by ELISA, apoptosis rates by annexin V (early apoptosis) and TUNEL (late apoptosis) techniques. The cell morphology was studied too. TNF-α release rate was highest in ST-invaded hepatocytes. ST and LM-1/2a induced the highest apoptosis production rates evaluated by TUNEL. LM-4b produced the highest apoptosis rate measured by annexin. Invaded hepatocytes presented various morphological alterations. Overall, LM-4b and LM-1/2a proved to be the most efficient at cell invasion, although ST adapted faster to the environment and induced earlier hepatocyte TNF-α release.

A invasão de hepatócitos por Listeria monocytogenes (LM) e Salmonella Typhimurium (ST) pode estimular a liberação do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e induzir a apoptose celular. Neste estudo comparamos o comportamento de hepatócitos invadidos por três sorotipos de L. monocytogenes (LM-4a, LM-4b e LM-1/2a) e por ST para entender qual bacteria é mais efetiva no processo infeccioso. Nós quantificamos a liberação de TNF-α pelos hepatócitos por ELISA e as taxas de apoptose pelas técnicas de anexina V (apoptose precoce) e TUNEL (apoptose tardia). A morfologia das células foi estudada também. A taxa de liberação de TNF-α foi mais alta em hepatócitos invadidos por ST. ST e LM-1/2a induziram as maiores taxas de apoptose pelo método TUNEL, enquanto LM-4b produziu as maiores taxas de apoptose por anexina V. Os hepatócitos invadidos apresentaram várias alterações morfológicas. Na análise do conjunto de dados, os sorotipos LM-4b e LM-1/2a provaram ser os mais eficientes na invasão celular, enquanto que ST adaptou-se mais rápido ao meio e induziu a liberação precoce de TNF-α pelos hepatócitos.

Study of rat hepatocytes in primary culture submitted to hypoxia and reoxygenation: action of the cytoprotectors prostaglandin E1, superoxide dismutase, allopurinol and verapamil / Estudo de hepatócitos de rato em cultura primária submetidos a hipóxia e reoxigenação: ação dos citoprotetores prostaglandina E1, superóxido dismutase, alopurinol e verapamil

Context: Exposure of hepatocytes to pathological conditions in a microenvironment of hypoxia and reoxygenation is very frequent in hepatic diseases. Several substances present perspectives for cytoprotective action on hepatocyte submitted to reoxygenation after hypoxia and simple hypoxia. Objective: We research therapeutic options for hepatocytes submitted to hypoxia and hypoxia + reoxygenation injury. Methods: Primary culture of rat hepatocytes was submitted to hypoxia (2 hours) plus reoxygenation (2 hours) and simple hypoxia (4 hours) in the presence or the absence of cytoprotectors. The hepatocyte lesion was evaluated by functional criteria through percentage of lactate dehydrogenase released and cell viability. The effects of the cytoprotectors prostaglandin E1 3 ηg/mL, superoxide dismutase 80 μg/mL, allopurinol 20 μM and verapamil 10-4 M were studied in this model of injury. Results: Reoxygenation after hypoxia induced more significant lesion in cultured hepatocytes compared to simple hypoxia, detected by analysis of functional criteria. There was a significant reduction of percentage of lactate dehydrogenase released and a significant increase of percentage of cell viability in the hypoxia + reoxygenation + cytoprotectors groups compared to hypoxia + reoxygenation groups. Prostaglandin E1, superoxide dismutase and verapamil also protected the group submitted to simple hypoxia, when evaluated by functional criteria. Conclusions: We conclude that reoxygenation after hypoxia significantly increased the lesion of cultured rat hepatocytes when compared to simple hypoxia. Prostaglandin E1, superoxide dismutase, allopurinol and verapamil acted as cytoprotectors to the rat cultured hepatocytes submitted to hypoxia + reoxygenation in vitro. The substances prostaglandin E1, superoxide dismutase and verapamil protected hepatocytes submitted to simple hypoxia on the basis of all the criteria studied in this experimental model.

Contexto: A exposição dos hepatócitos a condições patológicas em que ocorram microambientes de hipóxia e reoxigenação são muito frequentes em doenças hepáticas. Várias substâncias apresentam perspectivas de ação citoprotetora para hepatócitos submetidos a reoxigenação após hipóxia e hipóxia simples. Objetivo: Pesquisaram-se opções terapêuticas para o dano dos hepatócitos submetidos a hipóxia e hipóxia + reoxigenação. Métodos: Hepatócitos de rato em cultura primária foram submetidos a hipóxia (2 horas) mais reoxigenação (2 horas) e hipóxia simples (4 horas), na presença ou ausência dos citoprotetores. A lesão dos hepatócitos foi avaliada por critérios funcionais através da percentagem liberada de desidrogenase láctica e da viabilidade celular. Os efeitos dos citoprotetores prostaglandina E1 3 ηg/mL, superóxido dismutase 80 μg/mL, alopurinol 20 μM e verapamil 10-4M, foram estudados neste modelo de injúria celular. Resultados: A reoxigenação após hipóxia induziu lesão mais significativa nos hepatócitos cultivados comparado com hipóxia simples, conforme demonstrado pela análise dos critérios funcionais. Houve significativa redução da porcentagem liberada de desidrogenase láctica e aumento significativo da percentagem de viabilidade celular nos grupos hipóxia + reoxigenação + citoprotetores em comparação com o grupo hipóxia + reoxigenação. Prostaglandina E1, superóxido dismutase e verapamil também protegeram o grupo hipóxia simples, quando avaliado pelos critérios funcionais. Conclusões: Conclui-se que a reoxigenação após hipóxia aumentou significativamente a lesão dos hepatócitos de rato cultivados, em comparação com a hipóxia simples. Prostaglandina E1, superóxido dismutase, alopurinol e verapamil foram citoprotetores para os hepatócitos de rato submetidos a hipóxia + reoxigenação in vitro. As substâncias prostaglandina E1, superóxido dismutase e verapamil protegeram os hepatócitos submetidos a hipóxia simples com base em...

Ascite: estado da arte baseado em evidências: [revisão] / Ascite: state of the art based on evidences: [review]

A ascite é o acúmulo de líquido livre de origem patológica na cavidade abdominal, fenômeno presente em várias doenças da prática clínica. A doença mais associada com ascite é a cirrose hepática. Na sua fisiopatologia destacam-se três teorias que ocorrem sempre em determinado paciente, porém em momentos diferentes de sua doença: vasodilatação, "overflow" e "underfill". O conceito mais moderno sugere que as três teorias estão presentes no mesmo paciente com cirrose, dependendo do tempo de evolução de sua doença. A teoria da vasodilatação estaria presente desde a fase pré-ascítica até a ascite de longa data. A teoria do overflow seria predominante nos primeiros meses de ascite e a teoria underfill explicaria a maioria dos achados em pacientes com ascite por longo tempo. Neste artigo são comentadas em detalhes as várias doenças que produzem ascite, os métodos diagnósticos empregados na pesquisa clínica da ascite, as complicações da ascite e as opções terapêuticas disponíveis. Em cada item é mostrado o grau de evidência (A até C) presente na literatura médica.

The accumulation of free fluid of pathological origin in the peritoneal cavity is named ascites, and, in clinical practice this phenomenon is present in several diseases. The most common cause of ascites is liver cirrhosis. In the pathophysiology of ascites three theories are noteworthy: vasodilation, overflow and underfill. The modern concept suggest that these three theories are present in the same patient with cirrhosis depending on the disease evolution time. The vasodilation theory would be important in the pre-ascitic phase as well as during all the ascites evolution time. The overflow theory would be important in the first months of development of ascites in cirrhosis, and the underfill theory would explain most of the findings in patients with ascites for a long time. This article comments in detailed, several diseases that produce ascites, the diagnostic methods employed in clinical investigation of ascites' complication and therapeutics options available. In each item the evidence grade (A to C) found in medical literature is shown.

Correlation between serum tumor necrosis factor alpha levels and clinical severity of tuberculosis

This study verified the correlation between the serum levels of TNF alpha and different clinical forms of tuberculosis. We described a group of 24 patients presenting several clinical forms of tuberculosis and a control group of 13 healthy individuals. The levels of TNF alpha were measured by bioassay method. The levels of TNF-alpha had significant differences between the tuberculosis and control groups. The patients with abnormal chest X-Ray findings had higher TNF alpha levels (15328.48 ± 4602.19 pg/mL) when compared to patients with normal X-Rays (3353.18 ± 1495.29 pg/mL) (p<0.05). Patients that lost weight had higher TNF alpha levels (15468.54 ± 4580.54 pg/mL) than those that didn't loose weight (2904.98 ± 1367.89) (p<0.05). The levels of TNF alpha were higher in patients with a positive PPD skin test than in those with a negative PPD test (p<0.05). There was a positive correlation between patients' clinical severity and the serum levels of TNF alpha. In patients with successive measurements of TNF alpha, we observed that there was a drop in cytokine levels, and also a clinical improvement concomitantly. We concluded that there was a correlation between serum TNF alpha levels and chest X-Ray alterations, loss of weight, positive PPD skin test and clinical severity in patients with tuberculosis. There was evidence of a worse clinical outcome in patients with tuberculosis that presented higher TNF alpha serum levels.

Measurement of peripheral blood mononuclear cells producing IFN-Gamma in patients with tuberculosis

The type of immune response induced by tuberculosis (Th1 or Th2) and its correlation with the clinical outcome is unclear. We studied 13 patients with active tuberculosis (TBC). The peripheral blood mononuclear cells producing IFN-gamma (PBMC-IG) were measured by enzyme-linked immunospot (ELISPOT) technique. The control group had ten healthy individuals vaccinated against tuberculosis. We collected blood samples of each patient in two moments: a) in the hospital admission without treatment (TBC1); b) after seven to 20 days of treatment (TBC2). The comparison of the spots forming units of PBMC-IG between TBC group and controls showed that there was a significant difference between TBC1 and control group (p < 0.001) and between TBC2 and control group (p < 0.005), but there was no difference between TBC1 and TBC2 (p > 0.05). A positive correlation was found between PBMC-IG and hemoglobin value, as well as between PBMC-IG and weight loss. There was no correlation between PBMC-IG and other variables [age, erythrocyte sedimentation rate (ESR), C-reactive protein (CRP)]. We conclude that tuberculosis activates Th1 immune response due to increase of PBMC producing IFN-gamma. There was no difference between the first sample (TBC1) and the second sample (TBC2) of PBMC-IG. This result can have occurred due to treatment influence, or can indicate that the immune response reachs a plateau. The positive correlation among PBMC-IG and both hemoglobin level and weight loss indicates that may exist a link between patient's clinical status and the immune response intensity.

Rat hepatocyte invasion by Listeria monocytogenes and analysis of TNF-alpha role in apoptosis

Listeria monocytogenes, agente etiológico de infecção grave de origem alimentar, utiliza mecanismos sofisticados de entrada no citoplasma do hospedeiro e manipulação do citoesqueleto, resultando em morte celular. As interações entre células do hospedeiro e bactérias podem resultar em produção de citocinas como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-a). Hepatócitos têm potencial de produzir citocinas pro-inflamatórias como TNF-a, quando invadidos por bactérias. No presente trabalho demonstramos o comportamento dos hepatócitos invadidos por L. monocytogenes pela análise microscópica, determinação da produção de TNF-a por bioensaio e análise da apoptose pela técnica TUNEL. A presença da bactéria, na razão que variou de 5 a 50.000 bactérias por célula, induziu ruptura das monocamadas celulares. Observamos presença de bactérias internalizadas na 1ª hora de incubação por microscopia eletrônica. Os níveis de TNF-a aumentaram da 1ª hora de incubação até a 6ª hora, variando de 0 a 3749 pg/mL. Nas 7ª e 8ª horas de incubação, ocorreram quedas não significativas dos níveis de TNF-a, indicando possível saturação dos receptores celulares. A quantidade de TNF-a produzido por hepatócitos foi dependente do tempo de incubação, assim como da proporção entre bactérias e células. A taxa de apoptose aumentou diretamente com o tempo de incubação (1 h a 8 + 24 h), variando de 0 a 43%, assim como com a razão bactérias : células. Estes resultados mostram a habilidade de L. monocytogenes não-hemolítica em invadir os hepatócitos, e as principais conseqüências deste fenômeno são: liberação de TNF-a e indução de apoptose. Assim, podemos especular que hepatócitos usam apoptose induzida por TNF-a para liberar bactérias de seu interior, facilitando a destruição destas pelo sistema imune.

Os radicais livres de oxigênio e as doenças pulmonares / Oxygen free radicals and pulmonary disease

Os radicais livres de oxigênio são moléculas que apresentam elétrons não pareados em sua órbita externa, capazes de transformar outras moléculas com as quais se encontram, como proteínas, carbohidratos, lípides e o ácido desoxirribonucleico. Essas moléculas são geradas em situações clínicas onde microambientes de hipóxia são seguidos por microambientes de reoxigenação. Nesse grupo estão o choque hemodinâmico, a septicemia, a resposta inflamatória sistêmica, as hepatites fulminantes, o transplante de órgãos, e a insuficiência respiratória, entre outras condições. Neste trabalho discutimos os principais conceitos sobre os radicais livres de oxigênio: os principais tipos, sua formação e a forma como atuam sobre todas as estruturas celulares provocando lesão tecidual significativa. Os principais sistemas de defesa antioxidante existentes para combater o estresse oxidativo são comentados, com destaque para a glutationa, superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e N-acetilcisteína. A influência dos radicais livres de oxigênio sobre as principais doenças pulmonares também é discutida, com ênfase nos produtos do cigarro, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, apnéia obstrutiva do sono e síndrome do desconforto respiratório agudo.

The influence of the human genome on chronic viral hepatitis outcome

Os mecanismos que determinam o clearance ou a persistência da infecção viral nas hepatites virais crônicas não estão ainda bem identificados. O progresso no conhecimento sobre as ferramentas genéticas moleculares tem permitido detectar variações na resposta imune, que freqüentemente são associadas com polimorfismos do genoma humano. As diferenças na susceptibilidade do hospedeiro para as doenças infecciosas e a intensidade das doenças não podem ser atribuídas apenas à virulência do agente microbiano. Neste artigo são discutidos vários avanços recentes no conhecimento sobre a influência dos genes humanos nas hepatites crônicas B e C, a saber: a) As associações entre os polimorfismos HLA e a susceptibilidade ou resistência às doenças hepáticas virais; b) Alelos protetores influenciando as hepatites virais B (HVB) e C (HVC); c) Alelos prejudiciais influenciando HVB e HVC; d) Genes candidatos associados com a evolução clínica de HVB e HVC (genes que influenciam as células estreladas do fígado, a produção de TGF-beta1 e TNF-alfa, os depósitos de ferro hepáticos, a produção de angiotensina II, entre outros). O conhecimento das associações genéticas com as hepatites virais crônicas pode fornecer indícios para o pleno entendimento de como se desenvolvem as suas complicações terminais, como a cirrose e o carcinoma hepatocelular. Em futuro próximo, a análise do genoma humano será capaz de elucidar o curso natural de uma hepatite viral, bem como a sua resposta à terapêutica.

Typhoid fever as cellular microbiological model

The knowledge about typhoid fever pathogenesis is growing in the last years, mainly about the cellular and molecular phenomena that are responsible by clinical manifestations of this disease. In this article are discussed several recent discoveries, as follows: a) Bacterial type III protein secretion system; b) The five virulence genes of Salmonella spp. that encoding Sips (Salmonella invasion protein) A, B, C, D and E, which are capable of induce apoptosis in macrophages; c) The function of Toll R2 and Toll R4 receptors present in the macrophage surface (discovered in the Drosophila). The Toll family receptors are critical in the signalizing mediated by LPS in macrophages in association with LBP and CD14; d) The lines of immune defense between intestinal lumen and internal organs; e) The fundamental role of the endothelial cells in the inflammatory deviation from bloodstream into infected tissues by bacteria. In addition to above subjects, the authors comment the correlation between the clinical features of typhoid fever and the cellular and molecular phenomena of this disease, as well as the therapeutic consequences of this knowledge

Crise hemolitica aguda seguida por insuficiencia hepatica fulminante com evolucao fatal, como primeira manifestacao clinica da doenca de Wilson / Acute hemolytic anemia followed by a fulminant hepatic failure with lethal evolution as a first clinical manifestation of Wilson's disease

Descreveremos neste trabalho o caso clinico de paciente do sexo feminino, de 21 anos, portadora de doenca de Wilson, cuja primeira manifestacao clinica da doenca ocorreu como crise hemolitica aguda seguida por insuficiencia hepatica fulminante, com evolucao para o obito apos 26 dias de internacao. O diagnostico definitivo foi obtido apenas com a medida quantitativa do cobre hepatico em material de necropsia...

Dois casos de vasculite cutânea grave com plaquetopenia associada à cirrose hepática: componente autoimune e infecto-inflamatório com lesäo endotelial e padräo restritivo pulmonar em um caso / Two cases of severe cutaneous vasculitis with thrombocytopenia associated with hepatic cirrhosis: autoimmune and infect-inflammatory component with endotelial lesion and restrictive pulmonary pattern in one case

Descritos dois casos clínicos de pacientes do sexo feminino com cirrose hepática criptogênica em um e pelo vírus C em outro, com envolvimento autoimune multissistêmicos e intercorrência infecciosa. O caso 1 apresentou endocardite infecciosa e erisipela em membro inferior esquerdo. Em sua evoluçäo clínica ocorreu vasculite cutânea em membro inferior, plaquetopenia autoimune, leucopenia e quadro retritivo pulmonar com padräo inflamatótio. Havia imunecomplexos elevados e consumo de complemento. O caso 2 apresentou erisipela em membro inferior seguido por vasculite cutânea no local e consumo de complemento. O Caso 1 recebeu antibioticoterapia por 4 semanas para endocardite infecciosa, seguido por corticoterapia (prednisona) na dose de 1mg/Kg, com revisäo da plaquetopenia e leucopenia. O caso 2 apresentou melhora apenas com antibióticos. A relaçäo entre hepatopatias crônicas e fenômenos autoimunes sistemicos é discutida com ênfase para o comprometimento cutâneo, hematológico e pulmonar